Parte V: revelação de isoenzimas
No final da electroforese o gel era seccionado em 3 fatias com cerca de 1,6 mm [May 1991, Micales et al. 1986], cada uma para a respectiva revelação enzimática, na sequência de passos abaixo:
1. Colocava-se o vidro de suporte do gel sobre um pano de celulose húmido, para evitar deslizamentos, com o lado menor paralelo ao plano dos olhos;
2. Os cantos do lado esquerdo do gel (o do extremo catódico e o do extremo anódico) eram cortados para assegurar a correcta orientação dos zimogramas;
3. De cada um dos lados maiores do gel empilhavam-se réguas de fórmica com 1,6 mm de espessura (excepto o par inferior, com apenas 1 mm) e comprimento excedendo o lado maior do gel, tantas quantas necessário até chegarem logo abaixo da superfície do gel;
4. Usando fio de pesca esticado entre as duas mãos e apoiando nas duas pilhas de réguas, seccionava-se a fatia superior do gel atravessando-o horizontalmente;
5. Esta primeira fatia era rejeitada por ser de espessura irregular e não permitir boa resolução dos padrões de bandas, retirando-se em seguida o par de réguas superior, para nova secção;
6. A fatia obtida da secção seguinte era levantada do gel com o cuidado de evitar partir-se, e transferida para uma tina de revelação;
7. Retirava-se mais um par de réguas, seccionava-se uma nova fatia e transferia-se esta para outra tina de revelação, repetindo-se este conjunto de passos até chegar ao par de réguas inferior, assim não aproveitando a camada de gel adjacente ao vidro.
Geralmente, se não tiver desidratado e tiver espessura constante, um gel produzido a partir duma solução de amido de 300 mL produz 3 fatias que são réplicas entre si. Caso se verificasse que não era possível obter 3 fatias como esperado (passo 3 acima), podia optar-se por aproveitar o material junto ao vidro, aí sendo necessário utilizar uma régua de 1,6 mm na base da pilha, usando fio de pesca para no final separá-la do vidro. Mas a camada inferior geralmente tinha menos actividade enzimática que as outras, e quando se tinha de recorrer a ela, era para um enzima com atividade mais intensa ou de informação menos crítica (peroxidases no sistema C, superóxido dismutase no sistema R, ou fosfogluconato desidrogenase no sistema H).
2) Soluções de revelação usadas nas análises de rotina
Cada fórmula apresentada é para a revelação de 2 fatias de 2 geis, isto é, 80 amostras. A lista completa dos reagentes e formulários utilizados encontra-se no Apêndice III-C. Excepto onde indicado, a referência completa para cada procedimento é a da revisão de May [1991].
Actividade enzimática: desidrogenase do malato EC 1.1.1.37 (MDH)
5 mL DL-malato a 0,5 M neutralizado com bicarbonato de sódio [May, 1991] + 10 mL Tris 1 M pH 8,5 + 82 mL água + 1 mL de NAD a 20 mg/mL + 1 mL brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio a 10 mg/mL (MTT) + 1 mL metossulfato de fenazina a 2 mg/mL (PMS).
Incubação 2 horas à temperatura ambiente ou a 37 ºC, protegida da luz. Diferenciação com mistura de 1 volume ácido acético (Merck 100063) + 4 volumes de água + 5 volumes de etanol (Merck 100983) (adiante designado por AAE) durante 15 minutos, para remoção de MTT não reduzido.
Actividade enzimática: diaforase EC 1.6.4.3 (DIA)
25 mg NADH + 2 mg diclorofenol-indofenol + 10 mL Tris 1 M pH 8,5 + 89 mL água + 1 mL MTT.
Incubação 2 horas à temperatura ambiente ou a 37 ºC, protegida da luz. Diferenciação com AAE para remoção de MTT não reduzido.
Actividade enzimática: peroxidases EC 1.11.1.7 (PER)
12 mL acetato 0,1 M pH 5,0 + 86 mL água + 2 mL H2O2 3 % + 200 µL CaCl2 1 M + solução contendo 50 mg 3-amino 9-carbazol em 1,25 mL de N,N-dimetilformamida (Sigma D-4254).
Incubação 2 horas à temperatura ambiente ou a 37 ºC. Diferenciação com glicerina (Riedel de Haën 33224) a 50%.
Actividade enzimática: esterases EC 3.1.1.– (EST)
100 mg Fast Blue BB + 90 mL água + 10 mL fosfato 1 M pH 6,0 [Soltis et al. 1983] + solução de substrato composta de 40 mg de α-acetato de naftil + 37 µL de α-butirato de naftil + 1 mL de acetona.
Incubação durante a noite à temperatura ambiente, protegida da luz. Diferenciação com glicerina a 50%.
A utilização de β-acetato de naftil não revelava nada adicionalmente, enquanto com α-butirato de naftil [Bult & Kiang 1993] aumenta a consistência da revelação.
Actividade enzimática: isomerase de fosfoglucose EC 5.3.1.9 (PGI)
40 mg fructose 6-fosfato + 10 mL Tris 1 M pH 9,0 com 50 mM de MgCl2 [Selander et al. 1986] + 88 mL água + 1 mL de NAD + 1 mL MTT + 1 mL PMS + 50 U desidrogenase de glucose 6-fosfato de Leuconostoc mesenteroides (G6PD).
Incubação pelo menos 1 hora a 37 ºC, protegida da luz. Diferenciação com AAE para remoção de MTT não reduzido. O precipitado formado pelas PGI pode acumular-se a tal ponto que se torna difícil resolver as bandas formadas, por isso incubar sem vigilância depois da 1ª hora pode ser prejudicial. Além disso, esse precipitado tende a sair do gel para a solução à mínima agitação da tina, voltando a depositar-se nas proximidades da banda de origem e assim comprometendo ainda mais a resolução das bandas. Por isso, embora não fosse estritamente necessário para os objectivos do presente estudo, a dissolução em agarose (cf. as actividades do sistema H e secção “Notas”) impede esta difusão e permite no geral um muito superior controlo da revelação.
O tampão utilizado é o recomendado por Selander et al. [1986].
Actividade enzimática: dismutase do superóxido EC 1.15.1.1 (SOD)
20 mg “Nitro blue tetrazolium” + 1 mL Tris 1M pH 8,5 + 1 mL NAD + 3 mL PMS + 6 mL água + 10 mL solução de agarose a 1,6 % [Bult & Kiang 1993].
Incubação à temperatura ambiente e com luz solar incidente, até à manhã seguinte. Pode optar-se por omitir o NAD.
Actividade enzimática: redutase da glutationa EC 1.6.4.2 (GsR)
5 mg NADPH + 1 mg diclorofenol-indofenol + 1 mL Tris 1 M pH 8,5 + 8 mL água + 1 mL MTT + 50 mg glutationa oxidada (GSSG) + 10 mL solução de agarose a 1,6 % [Bult & Kiang 1993].
Incubação 2 horas a 37 ºC, protegida da luz. Diferenciação com AAE para remoção de MTT não reduzido.
Actividade enzimática: fosfoglucomutase EC 5.4.2.2 (PGM)
100 mg glucose 1-fosfato (Sigma G-1259 [Spencer et al. 1964, May 1991]) + 1 mL Tris 1 M pH 8,5 + 7,5 mL água + 1 mL NAD + 0,5 mL MTT + 1 mL PMS + 60 U G6PD + 10 mL solução de agarose a 1,6 % [Bult & Kiang 1993].
Incubação 2 horas a 37 ºC, protegida da luz. Diferenciação com AAE para remoção de MTT não reduzido.
A redução da quantidade de MTT para metade não comprometeu a formação específica de formazano e dá uma cor de fundo mais clara, com melhor contraste.
Actividade enzimática: desidrogenase de fosfogluconato EC 1.1.1.44 (PGD)
8 mg NADP + 20 mg 6-fosfogluconato + 1 mL Tris 1 M pH 8,5 + 100 µL MgCl2 1 M + 7 mL água + 1 mL MTT + 1 mL PMS + 10 mL solução de agarose a 1,6 % [Bult & Kiang 1993].
Incubação 2 horas a 37 ºC, protegida da luz. Diferenciação com AAE para remoção de MTT não reduzido.
A solução de agarose era preparada em água, com a dissolução feita em micro-ondas e adicionando ao restante da solução de revelação só depois da temperatura baixar aos 60 ºC aproximadamente; 20 mL (volume final) era suficiente para 2 fatias de gel, desde que só se aproveitasse a área contendo os enzimas (fácil de demarcar se usando o corante alimentar), distribuindo-se sobre a face exposta rápida mas cuidadosamente de modo a cobrir cada fatia por completo.
O enzima acoplador utilizado (G6PD, desidrogenase de glucose 6-fosfato de Leuconostoc mesenteroides, Sigma G-8408) tem a propriedade de utilizar indiferentemente o NAD ou o NADP como co-substrato, o que é economicamente muito vantajoso [Soltis et al., 1983].
