Os zimogramas produzidos por compostos corados eram observados imediatamente após a diferenciação, sobre um transiluminador de luz branca, enquanto os de produtos fluorescentes eram monitorizados periodicamente (intervalos de 15 minutos após a primeira meia hora de incubação) sob luz ultravioleta de 315 nm.

Em todos os casos os geis eram orientados com o lado anódico para cima, e graças ao corte feito nos cantos do lado esquerdo (cf. parte V secção A1) era possível identificar os zimogramas com o posicionamento das amostras no passo de colocação dos aplicadores de papel de filtro (cf. parte IV secção A3). Em geral não era difícil identificar as sucessivas amostras, mas para o caso de haver dúvidas, nomeadamente quando havia várias amostras negativas em sucessão, comparava-se entre fatias replicadas para fixar a ordem de cada amostra no gel.

O registo dos resultados era feito para cada actividade enzimática segundo as codificações que lhe eram específicas (cf. “Resultados” parte II), frequentemente acompanhadas duma redução esquemática das bandas presentes, como se exemplifica na figura 3.5.

Figura 3.5 — Exemplos de registo de resultados no caderno de laboratório. As primeiras duas linhas são o registo das amostras colocadas em cada gel (Sg e Sg⁺ são amostras de sangue, cor. um corante alimentar) seguindo-se do lado esquerdo num esquema-resumo das posições relativas das bandas observadas e da origem (or.) da electroforese. a) PGM. b) EST.

Figura 3.6 — Exemplo de registo fotográfico: electroforeses realizadas no dia 6 de Março de 2000, gel 2, DIA e MDH.

Estes registos eram, tão brevemente quanto possível, adicionados ao ficheiro Excel ANALISES.xls (incluído no CD anexo ao presente trabalho), onde cada folha corresponde a uma série de extracção, exceptuando os híbridos com uma folha àparte. Os registos nesta folha de cálculo eram verificados por uma segunda pessoa, confrontando-os com os registos no caderno de laboratório.

Só quando finalizada a observação directa e registo se decidia se havia interesse em guardar a imagem do zimograma em fotografia, o que era feito após legendagem do gel com inscrições da data, do sistema de separação e da actividade enzimática (figura 3.6).

O CD anexo ao presente trabalho contém todos os resultados de tratamento de dados realizados e o software de visualização (Columbus versão pessoal, distribuído com autorização expressa do fabricante Oasys, http://www.oasys-software.com/products/dm/columbus/).

As distribuições de frequência obtiveram-se com base no ficheiro Quattro Pro zimogramas.qpw, adaptado a partir do ANALISES.xls, no qual todas as amostras (2430 no total, tendo-se incluído observações mais antigas que não figuravam no ANALISES.xls) foram ordenadas pelas séries respectivas. Esta folha de cálculo foi convertida numa tabela Paradox (zimogramas.db), à qual se adicionou um campo chamado “freq”, com valor 0 por defeito, para a apresentação dos resultados. A partir desta tabela, com programa Corel Paradox 9, definiram-se filtros e algoritmos de consulta (queries) no sentido de classificar as amostras segundo os mais diversos critérios, produzindo-se subtabelas (azinheiras.db, sobreiros.db, etc.) onde outros filtros e quesitos podiam ser aplicados. Destas distribuições de frequência podiam calcular-se as estimativas mais diversas.

Exemplos de ficheiros SQL utilizados nestas operações, com comentários sobre o seu conteúdo, encontram-se no Apêndice IV secção B.

No presente estudo a descrição do potencial de cada marcador genético em termos de detecção de hibridismo ou introgressão é baseada em cálculos de especificidade e sensibilidade apenas para as actividades que foram incluídas em análises em larga escala. A probabilidade dum marcador produzir uma classificação incorrecta tanto pode constituir uma perda de especificidade como de sensibilidade, dependendo do ponto de vista com que se utiliza esse marcador. No presente estudo, usou-se na prática o ponto de vista da classificação de cada indivíduo como sendo diferente de sobreiro ou não. Assim, a presença dum zimograma de híbrido ou de azinheira é um “positivo”, e a sua ausência um “negativo”. Todos os indivíduos que sejam sobreiros e apresentem um tal zimograma são falsos positivos (e a sua proporção estima a perda de especificidade do marcador em causa em relação aos 100%), e todos os que não sejam e não apresentem esse zimograma são falsos negativos (perda de sensibilidade).

O cálculo das probabilidades de hibridismo nas parcelas mistas, tendo em conta que essas probabilidades eram presumivelmente baixas para não ser detectado nenhum híbrido de 1ª geração, usou-se o modelo de Poisson

, em que r é o número de ocorrências do evento para o qual se calcula a probabilidade e μ o número médio dessas ocorrências. Considerando r = 0 (não haver nenhuma ocorrência), e μ = NP, sendo P o valor a deteminar e N o número de indivíduos observados, P(0) = e^–NP, estimando-se P pela desigualdade 1 – e^–NP < α, tal que a probabilidade de haver 1 ou mais ocorrências é majorada por α. Obtém-se assim P < –log_e(1 – α)/N.

Para determinar se as parcelas mistas poderiam ser consideradas em conjunto, ou seja, se para cada espécie elas constituem uma só população, usou-se o método das tabelas de contingência para o número de alelos observados, em comparação com os esperados na hipótese de aplicarem-se as mesmas frequências a todas.

Na formulação do correspondente teste χ², trata-se de comparar as frequências p_ij (alelos i, parcelas j) com as frequências p_{i ·} do conjunto das parcelas, tal que (2N_jp_ij–2N_jp_{i ·})²/(2N_jp_{i ·}) para cada parcela, com N_j a representar a dimensão da amostragem (número de adultos) na parcela j. O número de graus de liberdade é dado pela diferença entre o número n×s de comparações (n alelos, s parcelas) e o número de parâmetros requeridos para estimar as frequências esperadas, (n–1) + s. Deste modo, obtém-se a fórmula

Outra tabela de contingência foi construída para examinar se havia independência de associação, entre gâmetas portadores de alelos de sobreiro e de azinheira, isto é, entre as 4 combinações ♀ sobreiro × ♂ sobreiro, ♀ sobreiro × ♂ azinheira, ♀ azinheira × ♂ sobreiro, e ♀ azinheira × ♂ azinheira. Neste caso a estatística χ² tem apenas 1 grau de liberdade, sendo necessário aplicar a correcção de Yates (subtracção de 0,5 ao valor absoluto do desvio entre frequência observada e esperada).

Usou-se o cálculo da estatística χ² para o teste à hipótese de que as frequências observadas se desviavam das esperadas devido ao acaso, para dois modelos: a 1ª Lei de Mendel, onde se prevê que os alelos num locus heterozigótico segreguem homogeneamente (isto é, ½ + ½) pelos gâmetas, e a distribuição de Hardy-Weinberg, que a cada frequência dum genótipo homozigótico faz corresponder o quadrado da frequência do respectivo alelo, e à dum heterozigótico o dobro do produto entre as frequências dos dois alelos relevantes. No segundo modelo o número de graus de liberdade é igual ao número de comparações menos o número de frequências alélicas necessárias para calcular os valores do modelo enquanto no primeiro é 1. Nos casos com 1 grau de liberdade, aplicou-se a correcção de Yates descrita na secção precedente.

Para cada locus com n alelos de frequências x_i, i = 1, ..., n, e na comparação entre as parcelas k = 1, ..., L, os parâmetros estimados foram:

Para cada par de populações A e B, obtêm-se identidades genéticas j_A = Σ_i (x_iA)², j_B = Σ_i (x_iB)² e j_AB = Σ_i (x_iAx_iB), e a identidade intrapopulacional média J_S = Σ_k (j_k)/L, donde se tira H_S = 1– J_S (nota-se ainda que (j_A)^–1 é o número efectivo de alelos nesse locus, A_e, para a população A). Entre todos os pares de povoamentos k e k' calcula-se a diferenciação entre povoamentos D_ST = (ΣD_kk')/(L)², com D_kk' = ½(j_k + j_k') – j_kk' (note-se que D_kk' = D_{k' k}, portanto cada valor numérico é representado 2 vezes no numerador de D_ST). Obtém-se assim o coeficiente de diversidade genética G_ST = D_ST/(H_S + D_ST) [Nei 1973, 1987, 1997].

A partir da diversidade genética ν = [Σ_i(x_i)²]^–1, idêntica ao número efectivo de alelos A_e, obtém-se a diferenciação total no povoamento δ_T = N(1 – 1/ν)/(N – 1), sendo N o número de indivíduos observados. Note-se o paralelismo entre δ_T para uma parcela e H_S para o conjunto de parcelas.

A diferenciação de cada povoamento j em relação aos restantes, D_j = ½Σ_i |x_ij – x_{i .}|, em que o segundo membro do módulo, x_{i .}, é a média aritmética das frequências x_i nos restantes L – 1 povoamentos. A estatística δ é a média dos L valores D_j, ponderada ou não pela dimensão de cada população, para servir de referência aos valores D_j [Hattemer 1991].

O coeficiente de fixação F_IT = 1 – H_o/H_e, em que H_o é a frequência (relativa) observada de heterozigóticos no conjunto dos povoamentos e H_e = 1 – Σ(x_i)², também referente ao conjunto dos povoamentos [Wright 1969]. A relação F = 1/(2N_e) para o cálculo de N_e (tamanho efectivo da população) aplica-se apenas numa situação de neutralidade. Adicionalmente, o valor de referência de F é 0 apenas se as distribuições de frequência nos gâmetas masculinos e femininos forem idênticas; caso haja diferenças Δx_i entre as frequências nos gâmetas masculinos e femininos, o valor de referência F_esp para F_IT é negativo e dependente do valor dessas diferenças (Apêndice II-C), pelo que a estimativa de N_e refere-se à diferença ΔF entre o valor observado de F_IT e o F_esp.

Coeficiente de fixação F_IS = 1 – LH_o/Σ_kH_ek, isto é, substituindo o H_e na fórmula de F_IT pela média aritmética dos H_e de cada povoamento k. Para que esta estatística seja credível, é necessário assumir um N_e constante para todos os povoamentos e L grande [Nei 1987, 1997].

F_ST = (F_IT – F_IS)/(1 – F_IS) é a medida de diferenciação entre povoamentos, ou seja do efeito de Wahlund [Wright 1965, 1969]. A partir deste valor obtém-se, assumindo que esta diferenciação é evolutivamente neutral, N_em = (1 – F_ST)/(4αF_ST), em que α = L²/(L – 1)² [Wright 1965, Slatkin 1995, Berg & Hamrick 1997].

Excepto onde indicado explicitamente, todos os cálculos foram realizados com o programa Corel Quattro Pro, versão 9, em plataforma Windows (32-bit). Cabe especial menção ao programa GENEPOP, versão 3.4, que permite realizar testes de hipóteses e estimações definindo os intervalos de confiança com base em cadeias de Markov [Raymond & Rousset 1995]. Os resultados do mesmo são apenas mencionados no texto onde seja relevante, e incluem-se os valores detalhados no CD anexo.