Parte II: Análises

A — Polimorfismos

1) Discriminantes entre sobreiro, azinheira e seus híbridos

Nesta secção listam-se as actividades que podem contribuir para a discriminação, incluindo aquelas que não foram utilizadas nas análises em larga escala, mas com referência apenas aos polimorfismos interspecíficos, isto é, que servem como critério de discriminação, deixando-se para a secção seguinte os polimorfismos intra-específicos.

DIA (sistema C)

Em sobreiro (folhas e sementes): migração de 1 a 4 actividades para o lado anódico do gel, sendo a mais rápida geralmente a que dá a banda mais intensa; em azinheira (folhas e sementes): semelhante a sobreiro, mas migração substancialmente mais rápida (figura 4.1 a, c). Em análises de rotina, a distinção entre as duas espécies é muito fácil, de tal modo que o conjunto das bandas de cada amostra é classificado como “Sb” e “Az”, respectivamente.

Nos híbridos (folhas), as actividades distribuem-se numa zona difusa, aparentando uma sobreposição entre as distribuições “Sb” e “Az”, codificado como “X” (figura 4.1 b). A extensão desta zona pode variar, aparentemente por analogia com a variação entre 1 a 4 bandas das espécies-tipo. Em sementes, não houve um único caso codificável como “X”.

Os padrões “Sb” e “Az” também se podiam obter no sistema R, mas a coloração era sempre menos intensa, o que levou à preferência pelo sistema C. No entanto, no sistema R só se observou 1 banda em sobreiro e azinheira, e 1 zona difusa em híbridos.

Figura 4.1 — Zimogramas DIA após separação no sistema C.

a) Aspecto geral dum gel.

b) Exemplos de híbridos (X) seguidos das respectivas descendências (F₂).

c) Exemplo duma variante “X” entre sobreiros (amostra 30AB, marcada com asterisco na imagem).

Foi utilizada nas análises em larga escala, obtendo-se um total de 2242 zimogramas identificativos (96,2% do total de análises).

MDH (sistema C)

Em sobreiro (folhas): migração de 7 actividades para o lado anódico do gel, e 1 para o lado catódico; em azinheira (folhas): migração de 5 actividades para o lado anódico, todas comigrando com as de sobreiro, e 1 para o lado catódico (mais lenta que a de sobreiro). A distribuição de intensidades permite distinguir facilmente as amostras de sobreiro, com intensidade máxima em geral das 2ª e 4ª bandas anódicas a contar da origem, das de azinheira, onde a intensidade máxima em geral é das 2ª e 3ª bandas anódicas; a actividade catódica também constitui critério de discriminação, apesar de nem sempre se detectar em azinheira (figura 4.2 a, b). Assim, e pelo facto de se presumir terem uma codificação genética separada (cf. secção B1), a classificação das amostras faz-se separadamente para os lados + e –, este último estipulado entre parêntesis, por exemplo “Sb(Sb)” para sobreiro e “Az(Az)” para azinheira.

Nos híbridos (folhas), do lado anódico aparecem 5 bandas bem definidas, comigrando com as 5 primeiras de sobreiro, e uma zona difusa distal que migra como a 6ª de sobreiro e a 5ª de azinheira; as mais intensas são em geral as 2ª, 3ª e 4ª; do lado catódico, aparecem 2 bandas comigrantes com as de azinheira e de sobreiro (figura 4.2 c). Este padrão de bandas é “X(X)”.

A única diferença entre folhas e sementes está na actividade que migra para o lado catódico, mais rápida que a de sobreiro e constante para as duas espécies, portanto sem ter valor discriminante. Assim, nas sementes onde foi detectada, representou-se com o classificativo “fast”.

Figura 4.2 — Zimogramas MDH após separação no sistema C.

a) Três exempos da diferenciação entre sobreiro (Sb) e azinheira (Az), em a₂ evidenciando especialmente a banda do lado catódico, e em a₃ mostrando como os marcadores anódico e catódico detectam um sobreiro (asterisco, amostra 31AO) entre azinheiras.

b) Esquema interpretativo (o zimograma da direita refere-se a sementes recombinantes “Az^” com a banda catódica “fast”, cf. secção B1).

c) Comparação entre zimogramas MDH e DIA para um mesmo conjunto de amostras incluindo 6 híbridos (X; da esquerda para a direita: MRM, SES, SM4, SM1, SM2, SM3) e 3 azinheiras descendentes de A36 com DIA “X” (asteriscos). Consegue-se notar a diferença de migração entre as bandas MDH do lado catódico entre os sobreiros, os híbridos e as azinheiras.

Foi utilizada nas análises em larga escala, obtendo-se um total de 2290 zimogramas identificativos (98,2% do total de análises). Das análises em folhas, as actividades do lado anódico contribuiram para classificar 97,7% das amostras, mas as do lado catódico apenas para 67,8%, em grande medida pela menor consistência das bandas de azinheira, visualizadas em apenas 44,7% das amostras que deram sinal no lado anódico (93,3% no caso das de sobreiro). Este facto terá de ser levado em conta na apreciação de material de origem híbrida, pois pode aparentar ser “Sb” no lado catódico e ser na realidade “X”.

EST (sistema C)

Realizou-se uma única tentativa, já no final do trabalho experimental, com folhas de 16 sobreiros, 5 azinheiras e 10 híbridos, e ainda 11 sementes (duma azinheira e dum híbrido). As sementes não revelaram nenhum sinal, enquanto nas folhas de sobreiro (9 amostras) e azinheira (5 amostras) apareceu 1 banda cinzento-escuro do lado catódico, mais rápida a de sobreiros, e uma actividade ténue do lado anódico, igual nas duas espécies. Nos híbridos (6 amostras), a migração desta actividade era como nas azinheiras, pelo que é um potencial marcador discriminante entre híbridos e sobreiros. Na figura 4.3 ilustra-se o resultado obtido.

Figura 4.3 — Observação de actividades EST (bandas cinzento-escuro) após separação no sistema C: detalhe dum gel com 3 amostras de azinheira (Az), 13 de sobreiro (Sb), e 10 de híbridos (X). As setas assinalam as posições das bandas do lado catódico em Az/X e Sb.

Por não terem sido feitas análises em larga escala, seria prematuro atribuir a designação “Sb” e “Az” a estas actividades, ficando a mais rápida como F e a mais lenta S, que poderão ou não confirmar-se em futuras análises corresponderem especificamente a sobreiro e a azinheira, respectivamente. A expressão nos híbridos carece de melhor esclarecimento, por não verificar-se a expectativa de codominância entre F e S.

GsR (sistema H)

Em sobreiro (folhas): migração de 3 a 7 actividades para o lado anódico do gel; azinheira (folhas): semelhante, 3 a 5 actividades, em que a mais rápida (ocorrendo em 99% dos casos) forma uma característica “banda” em crescente com a convexidade para o ânodo, e com distribuição de intensidades distinta da dos sobreiros, geralmente mais afastadas da origem (figura 4.4 a, b). Em análises de rotina, a distinção entre as duas espécies é muito fácil, de tal modo que o conjunto das bandas de cada amostra é classificado como “Sb” e “Az”, respectivamente.

Nos híbridos (folhas), as actividades distribuem-se numa zona difusa, aparentando uma sobreposição entre as distribuições “Sb” e “Az”, codificado como “X” (figura 4.4 c).

Figura 4.4 — Zimogramas GsR após separação no sistema H.

a) Aspecto geral dum gel com boa resolução das bandas.

b) Esquema interpretativo.

c) Comparação entre os padrões de azinheira, híbrido (X) e sobreiro, a partir dum mesmo gel, onde apesar da resolução das bandas não ser boa a distribuição espacial das actividades é satisfatória para a diagnose.

Este conjunto de características, e o facto de poder emparceirar com outras actividades separadas no mesmo sistema de separação (H), constituiu motivação para utilizar a GsR nas análises em larga escala, obtendo-se um total de 1591 zimogramas identificativos (70,6% do total de análises a folhas).

Uma única análise em sementes (de azinheiras e de híbridos) revelou uma distribuição de actividades muito diferente, com pelo menos 2 bandas por amostra no lado anódico do gel, e não permitiu determinar se há possibilidade de discriminação interspecífica.

PGM (sistema H)

Em sobreiro (folhas): migração de 1 actividade (por vezes parecendo tratar-se duma banda dupla) para o lado anódico do gel, monomórfica; em azinheira (folhas): migração de 1 ou 2 actividades para o lado anódico do gel, com muito polimorfismo (figura 4.5 a, b). Pelas posições no gel, e a partir do ânodo, as actividades foram designadas alfabeticamente (a, b, c para as de azinheira mais frequentes, e d para a de sobreiro), a que se veio juntar uma outra de azinheira, mais rápida que a, que se designou por a', e outra comigrante com a de sobreiro, que também se designou como d. Deste modo, os sobreiros eram todos d, e as azinheiras a, b, ab, etc..

Nos híbridos (folhas), a classificação deveria ser sempre uma combinação de a, b ou c, de azinheira, com d de sobreiro, mas isso foi confirmado apenas em SM3 (cd) — SM2 é d, e nos restantes não se obtiveram dados sobre as actividades PGM; no entanto, o mesmo princípio foi aplicado com sucesso às descendências de SM1, SM2 e SES (cf. secção B1), ao ponto de permitir dizer que SM1 seria ad (cf. tabela 4.10).

Figura 4.5 — Zimogramas PGM após separação no sistema H.

a) Dois exemplos de variação em azinheira, confrontada com a de sobreiro. Da esquerda para a direita, os fenótipos no primeiro são ac-a’b-ac-a’c-c-?-?-ac-?-bc, no segundo a-c-ac-?-bc-ac-c-?-a’b-ac.

b) Exemplo da banda d em azinheira (asterisco, amostra 28m). Da esquerda para a direita: ac-c-bc-bc-c-bd-c-c-ac-ac.

Foi utilizada nas análises em larga escala, obtendo-se um total de 1861 zimogramas identificativos (84,3% do total de análises a folhas, estimando-se 88,8% em sobreiros e 79,0% em azinheiras).

Uma única análise em sementes (de azinheiras e de híbridos) revelou uma distribuição de actividades muito diferente, com 1 a 5 bandas por amostra no lado anódico do gel, e não permitiu determinar se há possibilidade de discriminação interspecífica.

PGD (sistema H)

Em sobreiro (folhas e sementes): migração de 2 actividades para o lado anódico do gel, geralmente a mais rápida com sinal menos intenso; em azinheira (folhas e sementes): idêntico a sobreiro, mas algumas amostras (12,2%) apresentam uma 3ª actividade, de migração mais lenta que as outras duas (figura 4.6 a, b). Esta banda mais lenta (designada originalmente como banda b, como se explicará na secção 2) também apareceu em 2 híbridos e nas descendências de híbridos, o que levou a considerá-la discriminante. Assim, quando há apenas as 2 bandas constantes designou-se o padrão observado como “12”, se houver a 3ª banda (que não ocorre em sobreiro) como “12+b”. Como irá detalhar-se na secção 2, a banda 1 e especialmente a banda 2 têm outros polimorfismos, mas pela sua raridade na presente amostragem não foram levados em consideração para auxiliares de discriminação.

Figura 4.6 — Zimogramas PGD após separação no sistema H.

a) Em cima, aspecto geral dum gel com amostras de azinheira (Az) e de sobreiro (Sb), evidenciando na banda 2 variações em ambas as espécies; em baixo, detalhe de 2 geis com a ocorrência da banda discriminante 2b, e (direita) detalhe dum gel com amostras de semente. Assinalam-se com asterisco todas as amostras com banda 2b.

b) Esquema interpretativo, incluindo variações intraspecíficas (cf. secção 2).

Foi utilizada nas análises em larga escala, obtendo-se um total de 1934 zimogramas identificativos (85,8% do total de análises).

PGI (sistema R)

Em sobreiro (folhas e sementes): migração de 2 ou 4 actividades para o lado anódico do gel, sendo a mais rápida constante e as outras polimórficas; em azinheira (folhas e sementes): semelhante a sobreiro, mas as actividades polimórficas (de muito maior complexidade) em geral mais rápidas que as de sobreiro (figura 4.7 a, b). As actividades polimórficas de sobreiro tinham como pontos de referência duas localizações tipificadas pelas amostras com apenas uma banda nessa zona, as quais foram designadas a e b (mais rápida e mais lenta, respectivamente). As actividades polimórficas de sobreiro não migravam mais rapidamente do que a actividade que definia a posição a, que assim marcava um limite para a possibilidade de distinguir as amostras de azinheira em relação às de sobreiro; o facto das amostras apenas com 1 banda polimórfica na posição a serem frequentes em todas as electroforeses permitiu usá-las como referência visual interna para a discriminação nas azinheiras, sem necessidade de efectuar medições em cada gel (cf. figura 4.7 a): aquelas que tivessem actividades polimórficas mais rápidas eram classificadas como “Az”, enquanto as restantes (cuja actividade polimórfica comigrasse com a posição a de sobreiro) apenas podiam ser assinaladas com um “+” a assinalar a existência duma banda em posição não-discriminante. Quanto às actividades de sobreiro, quando havia 3 polimórficas isso era em geral reconhecido como uma banda mais difusa entre as duas posições de referência respectivas que correspondia ao genótipo heterozigótico (homodímero, cf. figura 2.10 b e 2.11 b), designando-se por exemplo ab quando as bandas exteriores comigravam com as posições a e b. A individualização do tripleto só foi conseguida nas revelações com camada de agarose.

Nos híbridos (folhas e sementes), a distribuição de actividades é semelhante à das azinheiras, adoptando-se o mesmo tipo de classificação (“Az”, “+”), excepto nos casos que apresentavam uma banda na posição b de sobreiro, acompanhada de 2 bandas com Rf acima do da banda a de sobreiro, classificados como “Az+b” (figura 4.7 b).

Figura 4.7 — Zimogramas PGI após separação no sistema R.

a) Ilustração das diferenças gerais entre sobreiros (Sb) e azinheiras (Az), com indicação (imagens da esquerda) da linha imaginária formada pelos zimogramas a de sobreiro e “+” de azinheira; realça-se ainda um exemplo de zimograma bc (amostra 21AG).

b) Exemplos de zimogramas invulgares ou de interpretação ambígua, num gel onde também se ilustra a PGI do sangue (Sg), que migra para o cátodo; * é uma azinheira proveniente de Santiago do Cacém (amostra 20Q); o zimograma bc é da amostra 21D; “?” (amostra 20b) é um caso invulgar, para azinheira, de migração mais lenta que a banda a de sobreiro (cuja posição se assinala a tracejado).

Foi utilizada nas análises em larga escala, obtendo-se um total de 2146 zimogramas identificativos (93,2% do total de análises).

EST (sistema R)

Em sobreiro (folhas e sementes): migração de um par de actividades, em geral difíceis de resolver, do lado anódico do gel; em azinheira (folhas e sementes): presença de 1 ou 2 actividades na proximidade da posição das de sobreiro, sendo uma nitidamente mais rápida que essa posição, e a outra ligeiramente mais lenta mas com uma diferença que não se pode considerar discriminante (figura 4.8 a, b). As azinheiras foram classificadas consoante tinham a banda discriminante (1), a banda não-discriminante (2) ou ambas (12), enquanto as amostras de sobreiro eram assimiladas à posição 2.

Nos híbridos (folhas e sementes) adoptou-se a mesma nomenclatura, sendo que a presença da banda 1 era discriminante em relação a sobreiro.

Figura 4.8 — Zimogramas EST após separação no sistema R.

a) Aspecto geral dum gel onde se evidenciam os diversos zimogramas “1”, “12” e “2” em azinheira.

b) Esquema interpretativo, incluindo variações intra-específicas (cf. secção 2).

Foi utilizada nas análises em larga escala, obtendo-se um total de 2138 zimogramas identificativos (90,5% do total de análises).

GDH (sistema R)

Em sobreiro (folhas e sementes): migração de 1 actividade para o lado anódico do gel, com Rf em relação à frente do tampão de aproximadamente 0,2; em azinheira (sementes): semelhante, mas com Rf de aproximadamente 0,32. Em concordância com a situação da EST no sistema C, relacionada com a ausência de dados em larga escala, designou-se a actividade mais rápida como F e a mais lenta S, que possivelmente correspondem a azinheira e a sobreiro, respectivamente.

Em sementes de híbridos, encontraram-se padrões F, S ou FS.

A actividade em folhas revela-se muito mais lentamente que em sementes, sendo necessário incubar durante uma noite, e talvez por isso foi considerada inconsistente nos rastreios iniciais (cf. parte I). A sua aplicação em larga escala, em sementes, é claramente viável: 45 das 47 sementes analisadas deram zimogramas identificativos.

ACP-F (sistema 9)

Em sobreiro (folhas): migração de 1 actividade para o lado anódico do gel; em azinheiras (folhas): semelhante a sobreiro, mas mais lenta (Rf 0,62–0,63 em referência à de sobreiro). Analogamente ao que se fez com a EST no sistema C e a GDH no sistema R, classificou-se a actividade mais rápida como F e a mais lenta como S, que possivelmente correspondem a sobreiro e a azinheira, respectivamente.

Devem observar-se as bandas antes de 1 hora de incubação, altura em que já existe demasiada difusão para uma resolução fiável; as de azinheira costumam ser mais intensas e observam-se facilmente ao fim de 30 minutos.

Não foram feitas observações em híbridos.

Em sementes a actividade pareceu ser menos consistente, mas com distribuição idêntica à das folhas, pelo menos em azinheira.

Com o sistema R, esta actividade (em folhas) é menos consistente e não parece permitir discriminação.

2) Intra-específicos

DIA (sistema C)

Houve variações na distribuição das intensidades, pois em vez de ser máxima na actividade mais rápida, como no que se considerou ser o padrão (figura 4.1), era mais ou menos uniforme em diversas amostras. Infrequentes, estas variações não interferiam com a discriminação e foram assinaladas com um asterisco, isto é, “Sb*” (1,8% das “Sb” em sentido lato), “Az*” (5,4% das “Az”) ou “X*” (1,1% das “X”). Na figura 4.9 ilustram-se algumas destas variantes.

Figura 4.9 — Exemplos de variação Az* (DIA, sistema C), assinaladas com asterisco.

MDH (sistema C)

Também ocorreu uma variante na distribuição de intensidades no lado anódico, apenas nos padrões “Az” (10,4% foram registados) e “X” (não registados). Esta variação causou muitas dificuldades na distinção entre os padrões híbridos e os padrões “Az*”, como se ilustra na figura 4.10: em rigor, só o aspecto difuso da actividade mais rápida em X, e a presença da 2ª mais rápida (quando é detectável e bem resolvida), é que permitem distingui-los de “Az*” (cf. figura 4.2 b).

Figura 4.10 — Variações na distribuição de intensidades no lado anódico dos zimogramas MDH de azinheira (padrões “Az*”) e um raro exemplo de migração diferencial (‡, amostra 29ao).

Outra variação observada, bastante rara (pelo menos 1 exemplo em cada espécie, assinalado com o símbolo ‡), caracterizou-se pela migração mais lenta do conjunto de bandas do lado anódico. As duas amostras onde isso foi notado foram submetidas a 2ª electroforese e o padrão manteve-se.

A actividade de azinheira que migra para o lado catódico do gel pode ser substancialmente mais lenta que o normal, o que se observou em 1,7% das amostras de azinheira e foi representado por “(Az+)”.

PER (sistema C)

Estima-se que foram 17 as actividades diferentes resolvidas no decurso das análises de larga escala. Os zimogramas PER foram divididos em 5 regiões, numeradas do ânodo para o cátodo, registando-se os resultados para a região 1, com uma única banda que se inicialmente pareceu ser diagnosticante de azinheira, a região 2 englobando 5 bandas, e a região 4, no lado catódico, compreendendo 7 bandas; as regiões 2 e 4 demonstraram bastante polimorfismo nas duas espécies, enquanto a região 3 (3 bandas próximas da origem de migração, 1 delas do lado anódico) e a região 5 (a actividade mais rápida do lado catódico) parecem ser constantes. Em todos os zimogramas as actividades do lado catódico eram muito menos intensas do que as do lado anódico. Na figura 4.11 ilustram-se as posições relativas das diversas bandas e a sua codificação no presente trabalho, e na figura 4.12 exemplifica-se a correspondência entre os zimogramas PER e outros, para um mesmo conjunto de amostras. A codificação para as bandas na região 2 foi alvo dalgumas revisões perspectivando critérios de discriminação envolvendo algumas das bandas que aqui se encontram, daí a aparente incoerência das classificações feitas, mas que o esquema desta figura permitirá esclarecer.

Figura 4.11 — Zimograma PER após separação no sistema C.

a) Conjunto de amostras de azinheira (Az) e de sobreiro (Sb). Os pontos assinalam posições de bandas para as regiões 2 e 4–.	b) Esquema interpretativo: bandas em traço contínuo, praticamente constantes em pelo menos uma das espécies; a tracejado, bandas variáveis.

Figura 4.12 — Exemplos de correpondência entre os zimogramas PER (sistema C) e outros, para um mesmo conjunto de amostras.

a) Três réplicas dum mesmo gel contendo 10 amostras de sobreiro (Sb), 6 de híbridos (X) e 4 de azinheiras (Az) após electroforese no sistema C, com revelação das actividades enzimáticas MDH e DIA (cf. figura 4.2c) e PER.

b) Duas azinheiras contaminantes numa família de sobreiro (amostras 25AV e 26B) identificadas como tal nos zimogramas PGM (apenas a primeira), GsR, PER (presença da banda 1) e MDH. Fenótipos PGM das azinheiras: c-c-b-bc-bc-cd-c-cd-c-ac; b (25AV).

A banda da região 1 acabou por ser excluída como critério de discriminação entre as espécies, nomeadamente para distinguir sobreiros de híbridos: 12,4% dos sobreiros identificados como tal pelo seu perfil isoenzimático apresentavam-na, assim reduzindo a especificidade deste marcador para azinheira; nos híbridos e suas descendências registou-se a banda 1 em 64,3% das amostras analisadas (tabela 4.5).

Tabela 4.5 — Expressão da banda 1 nas amostras de sobreiros, azinheiras e híbridos. “Indeterminado” refere-se a amostras onde não foi registada presença ou ausência da banda 1.

Contando apenas com as amostras onde foi feito o registo de presença ou ausência da banda 1, determina-se para este marcador uma especificidade de 83,9% e uma sensibilidade de 98,8%. A percentagem de híbridos e suas descendências com a banda 1, entre a registadas, foi de 90,2%, muito acima dos esperados 57,4% assumindo um valor intermédio entre sobreiro e azinheira.

No sistema de separação 4, a banda 1 é resolvida como um conjunto de 2 a 3 bandas, e o facto de variar a sua localização no gel frequentemente (figura 4.12 a), leva a pensar que existe um polimorfismo, nomeadamente nas azinheiras, associado a este marcador.

A banda 1 não foi detectada em sementes.

Nenhuma das variantes nas regiões 2 e 4 foi marcador útil para a discriminação. Apenas há a registar que qualquer das bandas polimórficas na região 4 teve uma prevalência inferior a 0,5% em sobreiro, o que talvez permita considerar as bandas + (6,7% em azinheira) e – (8,5%) como critérios auxiliares para a detecção de hibridismo; nos híbridos e suas descendências houve 2,7% com a banda +, e 1,3% com banda –. Quanto à região 2, ambas as espécies apresentaram as mesmas actividades, mas as bandas – (25,2% em sobreiro e 3,0% em azinheira) e * (2,5% em sobreiro e 11,0% em azinheira) eram de frequências bem diferentes duma espécie para a outra.

Foram analisadas 2199 amostras, das quais apenas uma (amostra 38.29) não deu sinal interpretável.

ADH (sistema C)

Esta actividade revelou-se apenas numa electroforese, em folhas de adultos das duas espécies e de 2 híbridos, com uma única actividade a migrar para o lado anódico do gel, com ligeiras diferenças (na ocorrência, 6 a 8 mm da origem) que não se voltou a ensaiar, para verificar se eram reprodutíveis e se podiam ter alguma utilidade para as análises a realizar. O polimorfismo nesta amostragem foi maior em sobreiro do que em azinheira, mas as formas “6”, “7” e “8” estavam presentes em ambas.

GsR (sistema H)

A variação em azinheira e em sobreiro resumiu-se a aparecerem ou não algumas bandas menos consistentes, e também a distribuições de intensidade diferentes (a ausência de certas bandas em azinheira foi codificada como Az* e Az**, referenciada na figura 4.4 b), analogamente ao que foi descrito para DIA, mas que não interferiram com a discriminação.

PGM (sistema H)

Enquanto em sobreiro (folhas) era aparentemente monomórfica (na realidade, em muitos zimogramas parecia tratar-se dum dupleto de bandas que era difícil de resolver e podia eventualmente implicar alguma variação), a PGM em folhas de azinheira mostrou-se altamente polimórfica, permitindo adoptar um sistema simples de classificação segundo a migração de cada uma das actividades, como já referido anteriormente. Visto ser a mais frequentemente observada em azinheiras (presente em cerca de 65% das amostras analisadas), a actividade c serviu de referência para a determinação do Rf (tabela 4.6):

Tabela 4.6 — Valores de Rf estimados para as diferentes bandas observadas em azinheira, usando como referência a posição da banda c (na mesma amostra ou interpolando entre as mais próximas no mesmo gel).

Este polimorfismo em azinheira será alvo de outras análises na secção B2.

PGD (sistema H)

No início do presente estudo foram detectadas duas variantes da banda 2, que foram designadas a e b (mais rápida e mais lenta que o padrão, respectivamente). Só a presença em azinheiras e híbridos da banda b discriminante se veio a demonstrar frequente, enquanto todas as outras variantes, tanto em sobreiro como em azinheira, eram raras (porém, é de admitir que certas diferenças subtis passassem despercebidas, em especial a banda 2–, ocorrendo com alguma frequência em sobreiro, que aparece como banda 2 mais lenta e mais difusa). Usando como referência a banda 1 (na sua variante “normal”), os valores de Rf obtidos foram: banda 2, 0,67–0,68 (58 medições); banda b, 0,50–0,54 (24 medições); banda 2* (já referida como banda a), 0,70–0,75 e/ou 0,83 (4 medições, possivelmente heterogénea). Não foram obtidos valores de Rf para as outras bandas (1', 2', 2–). Pelos menos as bandas a, b e 2– podem corresponder a heterozigóticos, mas não foi possível demonstrá-lo a partir dos dados recolhidos. A figura 4.13 ilustra algumas das variações encontradas (também com referência à figura 4.6 a, b), e na tabela 4.7 detalham-se as respectivas frequências nas duas espécies.

Figura 4.13 — Variações intra-específicas dos fenótipos PGD. a) Banda “a” ou “2*” em azinheira (amostra 21d); os asteriscos assinalam amostras com a banda b (pouco visível). b) Banda 2– em sobreiro (asteriscos, cf. também figura 4.6 a).

Tabela 4.7 — Distribuição dos polimorfismos de PGD em sobreiro (1028 amostras) e em azinheira (1048 amostras). Apenas se consideraram as amostras com actividades PGD identificáveis e cuja identidade taxonómica foi estabelecida sem ambiguidades pelo conjunto dos fenótipos isoenzimáticos obtidos em cada uma.

SKD (sistema H)

Esta actividade foi muito inconsistente, não pareceu ser discriminante, e acabou por não ser adoptada para análises em larga escala. No entanto, registou-se algum polimorfismo principalmente em sobreiro (também visível quando se usou o sistema R), traduzido em diferenças muito subtis de migração (figura 4.14).

Figura 4.14 — Zimograma SKD após separação no sistema H, notando-se algumas variações entre amostras de sobreiro, principalmente, mas também em azinheira.

PGI (sistema R)

O polimorfismo da PGI em ambas as espécies era notório em todos os géis, e nos casos em que a actividade polimórfica era constituída por 3 bandas, e com base na suposição de ser híbrida entre as duas de referência delimitando o tripleto, como já exposto na secção anterior, designava-se o zimograma por justaposição, no caso do sobreiro ab, ac, ou bc (a actividade c era infrequente e só apareceu isolada numa única amostra proveniente de Espanha, cf. parte IV, secção A). Nas azinheiras o polimorfismo era de tal maneira complexo que, por não constituir objectivo primário do presente trabalho, não foi registado sistematicamente. Mas houve um gel onde isso foi tentado, permitindo uma listagem provisória da variação também nesta espécie, paralelamente à de sobreiro. A mesma vem expressa pelos valores de Rf, medidos em relação à banda constante nas duas espécies (tabela 4.8).

Tabela 4.8 — Valores de Rf medidos para as diferentes bandas observadas em azinheira e sobreiro, usando como referência a posição da actividade monomórfica (banda 1) na mesma amostra. Os valores de Rf para as bandas de sobreiro representam margens de variação entre valores médios nas diferentes electroforeses (10 para a banda a e 6 para a banda b), patenteando a incerteza quanto aos valores exactos, relacionada com o aspecto difuso das bandas quando se utiliza a imersão para revelar as actividades. Em azinheira, o total de medições com Rf entre 0,61 e 0,65 foi 8.

De realçar a existência duma banda em azinheiras que parece ser mais lenta que a banda a de sobreiro, mas que em zimogramas bem resolvidos poderá ser diferenciada dessa e da banda b. O polimorfismo em sobreiro será alvo de outras análises na secção B2.

De maior relevância para o presente estudo é a proporção de azinheiras com fenótipo “+”, isto é, indistinguível da banda a de sobreiro. A sua frequência nas descendências classificadas como azinheira variou entre 6% em Feijoas e 24% em Azeiteiros, globalmente 19% (nas dos híbridos, como seria de esperar, era mais elevada ainda, 37%). Tratando-se de homozigóticos para este locus, conclui-se ser um dos alelos de azinheira mais frequentes, senão mesmo o predominante, mas o facto de ser dos mais lentos não é consistente com resultados anteriores em Espanha e no Algarve [Michaud et al. 1995], o que teria de investigar-se num estudo mais centrado neste polimorfismo.

EST (sistema R)

Para além das bandas EST 1 e 2 em azinheira (e as aparentemente constantes “2” de sobreiro), registaram-se outras ocorrências que se designaram como 1* ou 1' (actividade ligeiramente mais rápida do que a 1 de azinheira) e 2' (mais rápida que a 2, quase a meio em relação à banda 1). Actividades com migração substancialmente mais lenta, designadas segundo o mesmo critério como 3 e 4, foram observadas nas duas espécies (figura 4.15, e figura 4.8 b). Como mostra a tabela 4.9, apenas a ocorrência de bandas “3” se pode considerar de algum significado.

Figura 4.15 — EST: exemplo de ocorrência de banda 3 (amostra 29z, fenótipo 123).

Tabela 4.9 — Distribuição dos polimorfismos de EST por sobreiro (945 amostras) e por azinheira (957 amostras). Apenas se consideraram as amostras com actividades EST identificáveis e cuja identidade taxonómica foi estabelecida sem ambiguidades pelo conjunto dos fenótipos isoenzimáticos obtidos em cada uma.

SOD (sistema R)

Sobreiros e azinheiras apresentam em geral 2 actividades migrando para o lado anódico do gel, evidenciadas como bandas relativamente difusas por contraste negativo (figura 4.16). A actividade mais rápida é constante, e a mais lenta tem um Rf (referente à banda constante) variável de amostra para amostra, mas dentro duma margem estreita (sobreiro: Rf 0,80–0,90; azinheira: 0,84–0,92) que pode tornar problemática a interpretação de cada variante. Nalgumas amostras (duma e doutra espécie) observa-se uma 3ª actividade, ligeiramente mais lenta ainda (Rf 0,73–0,80 em sobreiro e 0,82–0,84 em azinheira). A obrigatoriedade de medir o Rf em cada amostra, e o facto de não serem discriminantes, levou a que não se fizesse um registo sistemático destas variações.

Figura 4.16 — Zimogramas SOD após separação no sistema R. Os casos de 3 bandas são assinalados com asteriscos.

Omitindo o NAD da solução usada para revelar as SOD, a generalidade das amostras só apresentavam 1 actividade, apenas se visualizando 2ª banda nos sobreiros e nas descendências de híbridos (alguns destes até com uma 3ª banda). Se bem que não tenha sido feita uma comparação directa, aparentemente é a actividade polimórfica (intra-especificamente) que deixava de observar-se; contudo, com esta modificação (e talvez outros aperfeiçoamentos a montante, nomeadamente na selecção doutro sistema de separação, ou recurso a sementes) poderia talvez ganhar-se um marcador de hibridismo.

IDH (sistema 4)

Apesar de não ser muito consistente, esta actividade apresenta 1 ou 2 bandas por amostra, do lado anódico do gel, sendo que a segunda banda corresponde a uma actividade que migra muito mais rapidamente e é muito menos intensa. Quanto à banda mais intensa, nalgumas amostras ela pareceu ter uma localização ligeiramente diferente (migração mais lenta, aspecto difuso). Estas variantes foram observadas em amostras de adultos do povoamento misto da Mitra, e pelo menos nesta amostragem ocorreram quase exclusivamente em sobreiro.

3) Sistemas não-polimórficos

O aparente monomorfismo de ACP (sistema C), CAT, G2D e LAP (sistema R), apesar de serem bastante consistentes, fez com que fossem preteridos das análises de rotina.

B — Interpretações genéticas

Embora sem a realização de cruzamentos controlados para verificar o modo de segregação das variantes intra-específicas e interespecíficas, a dedução de interpretações genéticas não deixou por isso de ser possível: o conhecimento dos zimogramas das árvores-mãe permitiu formular hipóteses genéticas para alguns dos polimorfismos intra-específicos, e as descendências dos híbridos permitiram o mesmo para alguns dos polimorfismos interespecíficos. Em certos casos pôde ainda levar-se em conta observações doutros autores em espécies do género Quercus. Seja a nível intra-específico ou interespecífico, os genótipos das árvores-mãe e suas descendências permitiram ainda deduzir os genótipos dos grãos pólen intervenientes.

1) Famílias dos híbridos

DIA e GsR

Sem excepção, DIA e GsR apresentavam-se nas famílias descendentes de híbridos numa de 3 maneiras: como nos híbridos (“X”), como nos sobreiros (“Sb”), ou como nas azinheiras (“Az”) — ou seja, não apareceram novas variantes. Esta observação permite deduzir que apenas 2 alelos, 1 por espécie, produziram a variação, e que o aspecto difuso dos padrões “X” sugere uma estrutura quaternária oligomérica.

A multiplicidade de bandas correspondentes a cada alelo teria então de explicar-se através de variações epigenéticas (no sentido mais lato do termo), que se sabe serem comuns em isoenzimas e até motivaram a introdução do conceito de isoenzimas secundários [Poly 1997]. As hipóteses que podem produzir alterações no ponto isoeléctrico vão desde a transcrição alternativa (isto é, a partir de diferentes promotores), splicing alternativo, etc., às modificações pós-tradução; neste último nível só por si, a complexidade de situações é muito grande.

Uma outra possibilidade é a modificação in vitro, geralmente relacionada com as condições de extracção, de conservação, ou ainda durante a electroforese [Poly 1997]. Não havia lugar no presente trabalho para testar as diferentes hipóteses para cada actividade, mas o facto das actividades DIA se apresentarem como uma única banda quando a separação é feita no sistema R leva a colocar a hipótese de tratar-se dum artefacto da electroforese, possivelmente um fenómeno de polimerização. Certos polimorfismos enzimáticos registados, por exemplo para os padrões “Az*” e “Sb*” da DIA, podem resultar de variações nesse tipo de interacção (diferentes graus de polimerização) e não terem qualquer significado genético.

MDH

Verificou-se que a banda do lado catódico do gel se expressa nas descendências dos híbridos como se tratasse dum único locus codominante, e ainda que a variação no lado anódico se produzia separadamente, isto é, num locus (ou mais) diferente(s).

Esta última mostrou-se aliás de grande complexidade, presumivelmente agravada pela variação das distribuições de intensidades e consequentes dificuldades em classificar as amostras. Por exemplo, a actividade mais rápida de sobreiro ocorre por vezes em zimogramas que de outra maneira seriam classificados como sendo de azinheira ou de híbrido (registando-se esses casos como “Az^” e “X^”, respectivamente, figura 4.2 b). Outro zimograma foi designado X', semelhante ao X mas intermédio com Sb. É provável que estes padrões tenham surgido de recombinação em mais do que 1 locus nos híbridos, mas a interpretação genética exacta não foi possível.

Assim, excepto pela provável independência entre marcadores catódicos e anódicos, que aliás contribuiu para considerá-los separadamente nas análises, a única hipótese sobre a hereditariedade para estes isoenzimas resume-se à que foi acima enunciada para os marcadores catódicos.

PGM e PGI

Todas as descendências de híbridos analisadas (plantas) incluiam zimogramas PGM característicos de azinheira (“a”, “ac”, “c”), de sobreiro (“d”) e de híbridos (“ad”, “bd”, “cd”), compatível com a noção de que cada banda corresponde a um enzima monomérico codificado num único locus de alelos codominantes, em que os heterozigóticos apresentam 2 bandas e os homozigóticos 1 banda (cf. fig. 2.10b e 2.11b). Já no que respeita à sementes, por não se dispor de dados em sobreiros e estes serem muito limitados em azinheiras, ainda não é possível interpretar os zimogramas obtidos.

Como referido na secção A1, as actividades PGI nas descendências de híbridos (folhas ou sementes) praticamente não diferem das de azinheira, e por isso foram classificadas como “Az” ou “+”; apenas numa minoria dos casos esta actividade fornecia informações úteis, mas um estudo mais atento da diversidade alélica em azinheira poderá vir a torná-lo ainda mais útil.

Outros marcadores

As actividades PER, EST (sistemas R e C) e GDH (esta só em sementes) não deram lugar a qualquer análise genética. Para EST (sistema C) e GDH isso pode dever-se à reduzida amostragem efectuada, para PER à complexidade dos zimogramas e aparente inconsistência entre diferentes extractos dum mesmo indivíduo, e para EST (sistema R) à incongruência entre os adultos e suas descendências. É plausível que os polimorfismos observados em PER e EST sejam uma expressão condicional, por exemplo em resposta a estímulos ambientais, de tal maneira que seja impossível dizer, em dado indivíduo, se a ausência duma determinada banda terá a ver com a ausência de expressão do respectivo gene ou com a substituição deste último por um seu alelo.

2) Famílias intra-específicas

PGM (azinheiras e híbridos)

A hipótese que a actividade PGM em folhas de azinheira e de híbridos e suas descendências é monomérica (como em Q. robur [White & White 1997, Gehle 1999]) e codificada num único locus com 5 alelos codominantes, cada um para uma das diferentes actividades resolvidas (a', a, b, c, e d), foi testada pela comparação entre cada família e a respectiva árvore-mãe — embora a efectividade deste procedimento seja afectada pela ocorrência (aliás frequente) de contaminantes originários de outras árvores, às vezes até da outra espécie, de que resultariam dúvidas sobre a hipótese em causa. Por exemplo, uma árvore com PGM c é considerada homozigótica e por isso todos os descendentes têm de conter a mesma banda c, acompanhada ou não de 2ª banda caso o alelo recebido com o pólen codificasse ou não (respectivamente) outra actividade; as descendentes duma árvore com PGM ac têm de conter pelo menos a ou c, etc..

Teve de aplicar-se o procedimento inverso para deduzir o fenótipo PGM provável de SM1, que não foi visualizado em gel apesar das tentativas feitas com dois extractos desta árvore: postulando que teria uma actividade do gene proveniente de sobreiro (d) e outra das que se podem observar em azinheira, a única compatível com o conjunto de zimogramas dos seus descendentes era a, assim assumindo-se o fenótipo ad para SM1.

Na tabela 4.10 resumem-se as observações realizadas. Apenas em 14 das 37 famílias se detectaram contradições entre as duas gerações, interpretando-se como contaminantes os casos de plantas jovens contraditórias, isto é, provenientes doutra árvore. De 441 observações, 55 foram assim consideradas (12,5% das amostras classificáveis, ou 13,6% de 403, se não se contar com as descendências de SM1), donde perto de metade estavam etiquetadas para uma só família (da árvore 21 de Alfaiates), onde aliás a maioria dos casos são de contaminação — no entanto, se por hipótese a árvore 21 de Alfaiates fosse ac e não a (possível caso a banda c fosse muito ténue, o que a posteriori não foi verificado), então todas as plantas consideradas contaminantes seriam verdadeiros descendentes, e a fracção de contaminantes (que não é forçosamente o complementar da especificidade deste marcador, cf. Parte III secção A) poderia baixar para 6,3%. Note-se, no entanto, que só com 1 locus polimórfico as estimativas de contaminantes terão de ser por defeito.

Tabela 4.10 — Separação entre descendentes e contaminantes, para cada árvore (azinheiras e, em Outeiro, híbridos), com base na interpretação genética para os zimogramas PGM obtidos: enzima monomérico codificado num único locus com alelos codominantes.

Em qualquer caso, pode considerar-se que o conjunto dos resultados da tabela 4.10 apoia claramente a hipótese enunciada; assim, no presente trabalho o locus para as actividades PGM detectadas nas folhas é designado Pgm, e os alelos para as diferentes posições no zimograma numerados do ânodo para o cátodo, isto é, Pgm¹ para a actividade a', Pgm² para a actividade a, e assim sucessivamente até Pgm⁵ para a actividade d.

PGI (sobreiros)

O facto de geralmente só se encontarem combinações de 2 actividades polimórficas (a e b) em cada gel revelado para PGI em sobreiros não permite testar a hipótese que foi colocada nas descendências atribuídas a árvores ab. Mas essa hipótese, que estes isoenzimas PGI são homodiméricos, codificados num único locus codominante, e onde os heterozigóticos produzem 3 bandas (figuras 2.10b e 2.11b), sustenta-se também em trabalhos anteriores que a utilizaram para material foliar [von Wühlisch & Nóbrega 1995, Gehle 1999, e ainda Toumi & Lumaret 1998, Michaud et al. 1995]. Usando esta hipótese, das 20 famílias atribuídas a árvores aparentemente homozigóticas (zimogramas PGI a ou b), 5 apresentaram contaminantes (que eram 3,1% do total das plantas jovens analisadas).

A mesma hipótese deverá ser válida para azinheiras [Michaud et al. 1995] e para os híbridos, mas como referido anteriormente apenas se registou se eram ou não discriminantes em relação a sobreiro, não sendo possível identificar os diferentes alelos.

PGD (azinheiras e híbridos)

Interessava verificar se o único polimorfismo frequente, o do aparecimento da banda b discriminante em relação a sobreiro, seria interpretável geneticamente, tendo em conta que as actividades PGD em Quercus robur são homodiméricas, codificadas num locus cada uma [von Wühlisch & Nóbrega 1995, Gehle 1999]. O padrão de 3 bandas esperado para heterozigóticos raramente se observou (foi mais fácil de observar nas muito intensas actividades extraídas de sementes, daí que fosse classificado diferentemente, “12hz” em vez de “12+b”), mas a única árvore “12+b” que produziu descendência foi o híbrido SM1, onde se contou apenas 1 planta descendente com o zimograma “12+b”, contra 15 que foram “12”, enquanto das 6 sementes observadas houve 4 classificadas como “12hz”, 1 como “12+b”, e 1 como “12–”. Face a estes resultados, não foi possível tirar quaisquer conclusões sobre a interpretação genética deste polimorfismo.

C — Sinopse

1.          Identificaram-se 8 actividades enzimáticas que, após análises de rotina em amostras de folhas e sementes dos povoamentos de referência, mistos e nos híbridos, se demonstraram capazes de contribuir para a discriminação entre sobreiros, azinheiras e seus híbridos: no sistema C, DIA e MDH; no sistema H, GsR, PGM e PGD; no sistema R, PGI e EST.

2.          Outras actividades que parecem ter o mesmo potencial, mas carecem de confirmação em análises de rotina: no sistema C, EST; no sistema R, GDH (só em sementes); no sistema 9, ACP-F.

3.          Identificaram-se polimorfismos intra-específicos em todos as actividades mencionadas no ponto 1 e ainda em PER e talvez ADH (sistema C), SKD (sistema H), SOD (sistema R) e talvez IDH (sistema 4).

4.          Conseguiram-se interpretações genéticas para os polimorfismos em DIA, GsR, PGM, PGI e (em parte) para MDH.