Parte I: Enzimas ensaiados

A — Revelação

Dum total de 35 actividades enzimáticas ensaiadas, em amostras de folhas e/ou sementes onde foi utilizado o meio de extracção desenvolvido no presente trabalho, houve 24 que deram sinal suficientemente intenso e nítido, em geral no lado anódico do gel, mas nalguns casos no lado catódico. A revelação duma actividade enzimática, num mesmo sistema de separação, era normalmente semelhante entre as duas espécies (as excepções são identificadas a seguir às tabelas 4.1 e 4.2). Analisam-se primeiro os casos onde a revelação da actividade em folhas foi consistente, isto é, sem haver praticamente resultados negativos de amostra para amostra ou de gel para gel.

1) Consistente

Neste grupo (11 actividades enzimáticas, tabela 4.1) incluem-se apenas as que, pelo menos num sistema de separação, produziam um sinal adequado para análise na generalidade das amostras, e sem contradições entre diferentes tentativas. Apenas estas, a priori, poderiam servir para uma análise em larga escala.

Tabela 4.1 — Lista das actividades enzimáticas, extraídas de folhas, consideradas consistentes em pelo menos 1 sistema de separação.

Actividadea | EC | Acrónimo | Sistemasb
Fosfatase ácida | 3.1.3.2 | ACP | C (HR9)
Fosfatase ácida (fluorogénica) | 3.1.3.2 | ACP-F | R9
Catalase | 1.11.1.6 | CAT | R 9*
Diaforase | 1.6.4.3c | DIA | CHR 4*
Esterase | 3.1.1.x (x=1,2,6) | EST | R C*
Glicerato DH | 1.1.1.29 | G2D | HR4
Malato DH | 1.1.1.37 | MDH | CH 4*
Peroxidase | 1.11.1.7 | PER | CH4 R*
6-fosfogluconato DH | 1.1.1.44 | PGD | H 4* (C)
Glucose 6-fosfato isomerase | 5.3.1.9 | PGI | R
Fosfoglucomutase | 5.4.2.2 | PGM | H (R)

a Abreviatura: DH, desidrogenase.

b Entre parêntesis, sistemas onde o sinal se apresentou algumas vezes muito fraco ou negativo (inconsistência). Os asteriscos assinalam sistemas em que foi feita uma única tentativa.

c Alternativamente, 1.6.99.1/3 [Acquaah 1992]

As actividades EST e PGD foram relativamente difíceis de evidenciar de início, mas no decurso das análises em larga escala, em que foram incluídas, foram consistentes. A actividade PGM foi menos consistente em azinheira (frequentes as amostras sem sinal) que em sobreiro.

2) Difusa, inconsistente, ou indeterminada

Ao contrário das da secção anterior, as actividades aqui incluídas (tabela 4.2) não ofereciam boas condições para uma análise em larga escala (que, contudo, veio a contar com a GsR, como será justificado na secção A da parte II). Num dos casos (AAT), porque o sinal, embora aparecesse consistentemente, era difuso, portanto presumia-se que não permitiria uma boa resolução das entidades moleculares e a diferenciação entre amostras; outras actividades enzimáticas eram inconsistentes, no sentido em que, quando se tentava a sua revelação no mesmo tipo de gel, frequentemente não apresentavam sinal algum, por isso não se conformando aos critérios do grupo da secção anterior; finalmente, houve vários casos (assinalados com um ponto de exclamação na tabela 4.2) em que se obteve sinal intenso e nítido num sistema (ou mais) no qual foi feita uma única tentativa, e por isso não se pode avaliar a respectiva consistência (indeterminadas).

Tabela 4.2 — Lista das actividades enzimáticas, extraídas de folhas, consideradas mal resolvidas, inconsistentes, ou com estatuto indeterminado por não terem sido feitas repetições.

Actividadea | EC | Acrónimo | Sistemasb | Comentáriosc
Aspartato aminotransferase | 2.6.1.1 | AAT | R (H*) | sinal difuso
Álcool DH | 1.1.1.1 | ADH | 4* (CHR) | !
Aldolase | 4.1.2.13 | ALD | 9* | ! negativo em C
Esterase (fluorogénica) | 3.1.1.2 | EST-F | R*9* | !
Glutamato DH | 1.4.1.2 | GDH | (H*M*R) |
Glutamato-piruvato transaminase | 2.6.1.2 | GPT | 9* | !
Glutationa redutase | 1.6.4.2 | GsR | R*4* (H) | !
Isocitrato DH | 1.1.1.42 | IDH | (H4) |
Leucina aminopeptidase | 3.4.11.1 | LAP | (R) | negativo em C (1 vez)
3-fosfoglicerato quinase | 2.7.2.3 | PGK | 9* | !
Chiquimato DH | 1.1.1.25 | SKD | M* (HR) | !
Superóxido dismutase | 1.15.1.1 | SOD | H* (R) | !
Tirosinase | 1.14.18.1d | TYR | C* | !

a Abreviaturas: DH, desidrogenase.

b Entre parêntesis, sistemas onde o sinal se apresentou muito fraco ou negativo em algumas tentativas. Os asteriscos assinalam sistemas em que foi feita uma única tentativa.

c Pontos de exclamação assinalam revelações possivelmente consistentes (assinaladas por asteriscos na coluna anterior) que não foram verificadas por falta de repetição.

d Alternativamente, 1.10.3.1 [Anderson 1968]

Aparentemente, GPT só apareceu em azinheira e não em sobreiro, não tendo sido ensaiada em linhagens de híbridos.

3) Actividades em sementes

Tendo-se feito em sementes um rastreio de actividades menos extenso do que em folhas, na maior parte dos casos com apenas uma análise, quase não se pode considerar a consistência de revelação excepto nas actividades (incluindo a GsR) que foram analisadas nas descendências de híbridos, que se confirmaram todas como consistentes nas sementes. Na tabela 4.3 resumem-se os resultados obtidos.

Tabela 4.3 — Lista das actividades enzimáticas, extraídas de sementes, que produziram algum sinal.

Acrónimo | Sistemasa | Comentários
AAT | 9* (R) | sinal nítido em R; H: negativa (1 vez)
ACP | (R) | 9: negativa (1 vez)
ACP-F | 9* (R) |
ADH | (R*) | não específico?b
ALD | (H*) | H: não específico?b R9: negativa (1 vez)
DIA | C H* |
EST | R 9* |
GAPD | (H*) | não específico?b
GDH | R H* |
G2D | (R*) | não específico?b
GsR | H* |
IDH | (H) | H: não específico?b R: negativa (1 vez)
LAP | R* |
MDH | C H* |
PER | C H* |
PGM | H |
PGI | R |
PGD | H |
SKD | (H*) |
SOD | R* (9*) |

a Entre parêntesis, sistemas onde o sinal se apresentou muito fraco ou negativo em algumas tentativas (inconsistência). Os asteriscos assinalam sistemas em que foi feita uma única tentativa.

b A comigração de diferentes actividades desidrogenásicas no mesmo gel levou a pôr em causa serem entidades diferentes, mas não foi feita uma verificação.

A maior parte das actividades listadas na tabela 4.1 também foram consistentes quando extraídas de sementes. De notar a melhoria de GDH no sistema R pelo menos, e possivelmente também de AAT, LAP e SOD no sistema R. Embora fosse testado uma única vez, o sistema 9 deu resultados positivos para três actividades, duas delas inconsistentes no outro sistema ensaiado.

B — Ausência de revelação

A tabela 4.4 lista as 11 actividades que não foram evidenciadas em material foliar.

Tabela 4.4 — Lista de actividades enzimáticas aparentemente indetectáveis nas amostras de folhas analisadas, com indicação dos sistemas de separação utilizados.

Actividadea | EC | Acrónimo | Sistemasb
Fosfatase alcalina | 3.1.3.1 | AKP | H
DH inespecíficas | 1.–.–.– | 0DH | CH (R)
Fructose bifosfatase | 3.1.3.11 | FBP | R (H)
Gliceraldeído PDH | 1.2.1.12 | GAPD | C
Glucose 6-P DH | 1.1.1.49 | G6PD | R (C)
Hexoquinase | 2.7.1.1 | HK | R
Lactato DH | 1.1.1.27 | LDH | CR
Enzima málico | 1.1.1.40 | ME | C
Peptidases | 3.4.(11/13).– | PEP | R
Fosfofructoquinase | 2.7.1.11 | PFK | R9
Xantina DH | 1.2.1.37 | XDH | R

a Abreviaturas: DH, desidrogenase; P, fosfato.

b Se entre parêntesis, sinal muito fraco e/ou difuso observado uma vez

Acrescente-se a ausência de sinal de EST (sistema de separação C) e de EST-F (sistemas H e R) em sementes — 1 tentativa em todos os casos.

Ressalve-se nesta lista o facto da maior parte destas actividades terem sido ensaiadas apenas num sistema de separação, algumas (AKP, HK, ME, PEP, XDH) uma única vez. Algumas, senão mesmo todas, poderiam eventualmente ser evidenciadas com outros sistemas de separação, ou com adaptações nos procedimentos de separação ou de revelação (até na adopção doutro método de extracção).

A análise de extractos doutras espécies, obtidos pelo mesmo método, demonstrou um sinal nítido de certas actividades que eram indetectáveis nos Quercus: a G6PD (sistema C) foi detectada em Acacia melanoxylon R. Br., Annona cherimola Mill., Brachychiton populneum R. Br., Calistemon citrinus (Curtis) Skeels, Casuarina cunninghamniana Miq., Cocculus laurifolius DC, Drymis winteri var. chilensis JR & G Forst/A. Gray, Hibiscus rosa-sinensis L., Macadamia terniflora Muell., Magnolia grandiflora L., Maurocenia frangula Mill., Myristica fragrans Houtt., Nerium oleander L., Portulacaria afra (L.) Jacq., Sapindus drummondii Hook & Arn., e Schinus molle L.; a ACP (sistema R) foi-o em Annona cherimola, Berberis vulgaris var. atropurpurea L., Brachychiton populneum, Calistemon citrinus, Cocculus laurifolius, Hibiscus rosa-sinensis, Magnolia grandiflora, Myristica fragrans, Myrtus communis L., Piper betle L., Peperomia obtusifolia (L.) Dietr., Sapindus drummondii, Schinus terebinthifolium Raddi e S. molle L..

C — Sinopse

1. A maior parte das actividades enzimáticas testadas em extractos de folhas de sobreiro ou azinheira produziram algum sinal em pelo menos um sistema de separação, embora apenas uma pequena minoria (11) fossem consideradas consistentes. Em termos de sistemas de separação, houve 6 actividades consistentes no R, 5 no H, 4 no C, 2 no 4 e 1 no 9.

2. Das actividades que não chegaram a ser consideradas consistentes, houve 9 que deram bons resultados numa única tentativa e podem vir a confirmar-se após repetição. Em termos de sistemas de separação, houve 4 actividades nestas condições no 9, 2 no 4 e no R, e 1 no M, no H e no C.

3. Em extractos de sementes os resultados foram essencialmente os mesmos que nos de folhas, embora pelo menos 1 actividade se revelasse consistente apenas naquelas.

4. Certas actividades foram detectadas em folhas doutras espécies de dicotiledóneas, ao contrário dos Quercus, podendo nesses casos excluir-se que fosse o método de extracção em si a causar a não-detecção nestes últimos.