Meios de cultura

(Protocolo aula prática n.º 1)

 

 

Introdução

O sucesso na tecnologia  e aplicação dos métodos de cultura in vitro devem-se a uma melhor compreensão dos requerimentos nutricionais das células e tecidos em cultura. Os dois factores que mas frequentemente determinam o sucesso de uma cultura de tecidos vegetais são a origem do explant e o meio nutritivo onde são cultivados. O meio nutritivo esta composto por elementos essenciais e por componentes opcionais.

Os nutrientes essenciais são: sais inorgânicas, os carbohidratos, as vitaminas e pelas fito-hormonas ou reguladores de crescimento (tabela 1). Outros componentes, incluindo as fontes de azoto orgânico, ácidos orgânicos e substâncias complexas, podem ser importantes em determinadas culturas, mas são opcionais.

1. Sais inorgânicas. Os nutrientes inorgânicos das culturas de tecidos são os normalmente requeridos pelas plantas. O azoto (N), Potássio (K); Fósforo (P), Cálcio (Ca), Enxofre (S) e Magnésio (Mg) são requeridos em quantidades milimolares (macro-nutrientes). A concentração óptima de cada nutriente para alcançar taxas de crescimento máximas, variam consideravelmente dependendo da espécie, do tipo de cultura, etc. No entanto para a maioria das culturas o meio nutritivo deverá conter entre 25 a 60 mM de azoto inorgânico. As células vegetais podem crescer com nitrato (NO-3) como única fonte de azoto, no entanto, frequentemente existe um efeito benéfico com a adição no meio de cultura de amónio (NH4+), sendo para algumas espécies um nutriente essencial. Outras fontes de azoto reduzido podem também ser adicionadas ao meio de cultura. O nitrato é normalmente usado em concentrações entre 25-40 mM. A quantidade de amónio pode variar entre 2-20 mM. Possivelmente a concentração óptima de amónio encontra-se entre 2-8 mM. As células vegetais podem viver num meio onde a única fonte de azoto seja o amónio, produzindo citrato, succinato, malato ou outro ácido do ciclo TCA. Também é possível fazer crescer células vegetais com outras fontes de azoto como são: ureia, glutamina, ou caseína hidrolisada.

O potássio, geralmente suplementado como nitrato de potássio ou cloreto de potássio é requerido em concentrações de 20 ou mais mM. As concentrações óptimas de P, Mg, Ca e S variam entre 1-3 mM sempre e quando os outros requerimentos sejam satisfatórios para as células em cultura. (DIZER APROX LA MOLARIDAD ...)

Os elementos que são requeridos em concentrações micromolares são o Ferro (Fe), Manganês (Mn), Zinco (Zn), Boro (Bo), Cobre (Cu), Molibdénio (Mo), pelo que são denominados micronutrientes. O Fe e o Zn são normalmente incorporados como quelatos (EDTA, Etilen-Diamin-Tretacetic-Acid). Também é importante a incorporação de Cobalto (Co) e de Iodo (I) no meio.

As plantas toleram bem grandes quantidades de cloro (Cl) e de Sódio (Na) no meio, e possuem aparente- mente efeitos na taxa de crescimento das culturas.

2. Carbohidratos. A fonte standard de carbono é a sacarose. A glucose e a fructose podem igualmente ser usadas. A glucose pode reemplazar com êxito a sacarose em meios específico. Outros carbohidratos que tem sido igualmente testados incluem a lactose, maltose, galactose, e amido, no entanto, estes compostos são geralmente muito inferiores a sacarose ou a glucose como fonte de energia. O sorbitol é usado em cultura de células de macieira e noutras plantas da família das Rosaceas. A sacarose é usada em concentrações entre 2-3%. 

3. Vitaminas. As plantas no seu ambiente natural sintetizam as vitaminas que são necessárias para o crescimento e desenvolvimento. No entanto, quando as células ou tecidos de plantas são colocados em cultura, algumas vitaminas tornam-se limitativas. Existe um requerimento absoluto de tiamina. As bases biológicas para este requerimento não tem sido ainda estabelecida. O crescimento das culturas de tecidos vegetais é incrementado quando se adiciona ao meio de cultura ácido nicotínico e priridoxina. Alguns meios também contem pantotenato de cálcio e biotina, mas estas e outras vitaminas (acido p-amino-benzoico, riboflavina, ácido ascórbico) que podem ser adicionadas, não se consideram factores de crescimento limitativos.

4. Fitohormonas As citocininas e as auxinas são as duas classes de compostos especialmente importantes na cultura de tecidos vegetais. Algumas fitohormonas naturais (sintetizadas pelas próprias plantas) são: o ácido indol-3-acético (IAA) e a zeatina (Z). Outras são reguladores de crescimento sintéticos como é o caso do 2,4-D (2, 4 dichlorophenoxyacetic-acid) e o BAP (Benzylamino-purina?). Uma auxina e nalguns casos uma (Ver tabela 1)

5 Azoto orgânico Entre os compostos usados como fonte de azoto orgânico nos meios de cultura destacam-se a glutamina, asparagina e adenina. A incorporação de azoto orgânico pode não ser necessária, no entanto, é frequentemente benéfico a sua incorporação, como é o caso da adição de L-glutamina. Na prática é corrente a adição  de 0.02-0.1 % de caseína hidrolisada. As células vegetais podem tolerar concentrações de mais de 8 mM de L-glutamina. Quando são incorporados amino-ácidos isoladamente deve ter-se em consideração o seu possível efeito inhibidor. Exemplos de amino-ácidos utilizados são a glicina (2 mg l-1), asparagina (100 mg l-1), L-tirosina (100 mg l-1), L-arginina e cisteina (10 mg l-1).

6. Ácidos orgânicos. As plantas não são capazes de utilizar ácidos orgânicos como única fonte de carbono. São escassos os trabalhos de investigação que se tem realizado para estabeler se os ácidos orgâncios podem ser factores limitativos ao crescimento das células em cultura. A adição de ácidos do ciclo tricarboxílico como malato, citrato, succionato ou fumarato permite o crescimento de células vegetais em amónio como única fonte de azoto. As células vegetais toleram concentrações superiores a 10 mM destes compostos.

7. Substâncias complexas Uma grande variedade de extractos tem sido usados. Entre eles hidrolisados de proteínas, extractos de leveduras de malta, assim como preparados vegetais como endosperma de milho, leite de coco, sumo de laranja e de tomate. Com excepção dos hidrolisados de proteínas e do leite de coco, as outras substâncias só são usadas como último recurso e frequentemente são substituídas por nutrientes mais específicos. As substâncias complexas, usadas em concentrações muito elevadas, podem afectar de forma negativa o crescimento das culturas in vitro. É aconselhável fazer um teste preliminar com concentrações que podem variar entre 0.1 a 1 g l-1, para avaliar o efeito no crescimento vegetal. O leite de coco é frequentemente usado a 2-15 % (v/v).

8. Mio-inositol A maior parte dos meios  de cultura contêm mio-inositol. Este não é um requerimento absoluto, no entanto quantidades de aproximadamente 100 mg l-1 incrementam

9 Carvão activado

Escolha do meio de cultura

Uma grande variedade de meios de cultura tem sido testados (os de uso mais corrente encontram-se no Anexo 1). Um meio de cultura é identificado pela composição em sais minerais. As vitaminas,  hormonas e outros suplementos orgânicos variam amplamente com respeito a sua composição e concentração. A escolha do meio de cultura depende da espécie em questão e do propósito da cultura (cultura de meristemas, organogénese, embriogénese somática, etc.). O meio de Murashige e Skoog, 1962 (MS) é um meio universalmente usado especialmente para morfogénese (Tabela I), cultura de meristemas e regeneração de plantas. Este meio caracteriza-se pela sua elevada concentração em sais minerais. O meio de Gamborg (B5) contém quantidades mais baixas de sais minerais, o que parece ser preferido pelas células de determinadas espécies (Tabela I)

 

Tabela I. Concentração molar dos nutrientes inorgânicos dos meios de Murashige e Skoog (1962) e Gamborg (data).

 

Macronutriente (mM) MS B5  
N (NO3) 40 25  
N (NH4) 20 2.0  
K 20 25  
Mg 1.5 1.0  
P 1.25 1.1  
Ca 3 1.0  
S 1.5 1.0  
       
Micronutriente (uM)      
Na - 61.1  
Cl 6.0 2.0  
I 5.0 4.5  
B 100 50  
Mn 30 7.0  
Zn 1.1 1.0  
Mo 0.1 0.15  
Cu 0.1 0.1  
Co      
Fe      
       

 

Característica dos meios de cultura

Se bem os meios líquidos apresentam vantagens económicas incontestáveis (sem ágar, sub-culturas mais rápidas por parte dos técnicos, que não tem que posicionar as plantas como acontece num meio sólido) eles são menos usados pelos laboratórios industriais porque necessitam um sistema de agitação constante, nem sempre fácil de instalar. A escolha entre um meio líquido e um meio sólido é arbitrária e depende especialmente das possibilidades do utilizador, mais que de considerações específicas. No entanto, nalguns casos é benéfico a alternância de meios sólidos e líquido durante as diferentes fases de desenvolvimento de uma cultura. A absorção de nutrientes é variável de umj meios a outro, condicionando sem dúvida um metabolismo diferente mas de um modo geral, os gradientes de oxigénio jogam um papel determinante sobre a orientação do processo da organogénese. Os meios solidificados com substâncias como: ágar, agargel, fitagel, agarose, gelrite, etc. tanto a qualidade como a quantidade são importantes e influenciam as culturas. A dureza do gel obtido (ágar entre 6 a 10 g l-1) depende da concentração usada e do tipo de substância seleccionada. O Difco-Bacto Agra (um dos mais usados, pelas suas características) pode ser substituído com êxito por outro ágar menos puro (mais barato) em laboratórios industriais. Um gel duro, por excesso de ágar é frequentemente nefasto para o crescimento dos tecidos. Por outra parte os meios de baixa concentração em ágar perdem água facilmente por evaporação, sendo por outro lado difícil manter neles os explants correctamente posicionados. A escolha da quantidade de ágar resulta de um compromisso entre um meio duro que minimize as perdas de água e um meio mole que permite uma melhor difusão dos nutrientes. Para uma mesma quantidade de ágar, os geles são mais ou menos consistentes dependendo da acidez do meio. O pH é um factor importante. O pH do meio (geralmente entre 5-6) é ajustado com KOH ou NaOH logo da preparação do mesmo e prévia adição do ágar. O pH do meio modifica-se durante a autoclavagem do mesmo (geralmente acidifica) e durante o decurso da cultura. Os meios de pH baixo (4.5) são geralmente usados em plantas que vivem normalmente em meios ácidos como é o caso das Ericaceas.

 

 

Preparação de meios

 

Procedimento

Existem na prática duas formas de preparar meios de cultura: a) preparar um litro de meio de cultura pesando e adicionando sucessivamente cada um dos compostos; b) preparar um litro de cultura a partir de soluções mães (stock) previamente preparadas e armazenadas.

 

 

Preparação de uma solução stock de macronutrientes

 

No existe uma regra geral para a preparação das soluções-stock, cada laboratório pode desenvolver um protocolo próprio segundo as suas necessidades. Assim a concentração das soluções stock de macronutrientes podem ser 20, 50, 100 vezes concentradas. Os micronutrientes dada as baixas quantidades em que são usados devem ser preparados em soluções stock de concentrações superiores a 500 vezes.

 

Tabela II. Soluções stock para o meio de MS

 

Macronutrientes 

Micronutrientes

Vitaminas

Composto  stock x10 (mg l-1)

Conc.

 final (mg l-1)

Composto 

stock x100 (mg l-1)

Conc. final 

(mg l-1)

Composto

 stock x500 (mg l-1)

Conc. final (mg l-1)
NH4 NO3 16500 1650 Mn SO4.7H2O 2230 22.3 Tiamina -HCl 0.02 0.1
KNO3 19000 1900 H3BO3 620 6.2 Ac. Nicotínico 0.10 0.5
Ca Cl2 .2H2O 4400 440 CuSO4. 5H2O 2.5 0.025 Piridoxina-HCl 0.10 0.5
KH2PO4 1700 170 CoCl2.6H2O 2.5 0.025 Glicina 0.40 2.0
MgSO4.7H2O 3700 370 NaMoO4.2H2O 25 0.25 Mio-inositol 20 100
      KI 83 0.83      
      ZnSO4 .7H2O 860 8.6      

Adicionar 10 ml do stock por cada litro de meio para obter a concentração final desejada 

Adicionar 1 ml por cada litro de meio para obter a concentração final desejada 

Adicionar 5 ml por litro de meio para obter a concentração final desejada

 

 

Preparação de uma solução stock de quelato de Ferro (x10)

Para preprar uma solução stock de quelato de ferro 10 vezes concentrada proceder da seguinte forma:

  1. Dissolva 2.78 g de sulfato ferroso heptahidratado em 350 ml de água destilada ou dibestilada.

  2. Dissolva num outro recipiente 3.73 g de Na2-EDTA (Ácido-etileno-diaminotetracético, sal di-sódica). Leve aquecimento é recomendável.

  3. Quando os dois componentes se tenham dissolvido completamente, combinar ambas as soluções e levar o volume final a 1 litro usando água destilada ou bidestilada. A solução obtida deverá ser levemente amarela e transparente. A concentração dos componentes usados na preparaçãp, baseia-se na formulação de base do meio de Murashige e Skoog.

Armazenamento das soluções-stock

As soluções stock deverão ser armazenadas em frascos de vidro ou recipientes de plástico opacos (para evitar a alteração dos compostos pela luz) e guardaos no frigorífico (0-4ºC). As vantagens dos plásticos actuais (polistirene, polisulfone, por ex.) reside principalmente na posibilidade de obter formas e dimensões bem adaptadas as necessidades dos laboratórios e na sua ausência de contaminantes iónicos. 

As soluções stock de vitaminas deverão ser armazenadas no congelador e descongeladas á temperatura ambiente

 

Preparação das soluções stock dos reguladores de crescimento

As auxinas são geralmente usadas nas culturas de tecidos a concentrações entre 0.01 - 10.0 mg l-1. Quando adicionadas nas concentrações apropriadas regulam o alongamento e divisão celular, a formação de raízes adventícias, inibição do aparecimento de rebentos adventícios e axilares, iniciação de callus e crescimento e indução de embriões.

As citocicinas são geralmente usadas a concentrações entre 0.1-10.0 mg l-1. Quando são adicionadas em quantidades adequadas regulam a divisão celular, estimulam a proliferação de rebentos axilares e adventícios, regulam a diferenciação celular, inibem a formação de raízes, activam a síntese de RNAS e estimulam a actividade proteica e enzimática.

Modo de Preparação. Para obter uma concentração final de 1.0 mg l-1 do regulador no meio de cultura pode proceder da seguinte forma: Prepare uma solução stock de 1mg ml-1 do regulador que deseja adicionar da seguinte maneira: (100 mg do regulador de crescimento desejado a 100 ml de água numa proveta graduada. Adicione 2 - 5 ml do solvente para dissolução do produto (gerlamente pó). Uma vez que esteja completamente dissolvido complete o volume. Agite a solução durante a preparação. Armazene segundo recomendado na tabela?. Adicione 1.0 ml da solução stock a 1 litro de meio para obter uma concentração final de 1.0 mg l-1 do regulador no meio de cultura.

A seguinte fórmula pode ser usada para efectuar cálculos de concentrações e volumes desejados.

 

Quantidade do regulador desejado   X  volume do meio  =  Volume da solução-stock requerida

                     Concentração da solução stock

 

 

Tabela III

 

B

Concentração da solução stock

C

Quantidade a usar em ml

A

Concentração da solução final (mg l-1)

 

 

250

500

1 litro

2 litros

10 litros

0.01 mg l-1

0.1

0.004

0.002

0.001

0.0005

0.0001

 

0.5

0.02

0.01

0.005

0.0025

0.0005

 

1.0

0.04

0.02

0.01

0.005

0.001

 

10.0

0.4

0.2

0.1

0.05

0.01

 

0.1 mg l-1

0.1

0.04

0.02

0.01

0.005

0.001

 

0.5

0.2

0.1

0.05

0.025

0.005

 

1.0

0.4

0.2

0.1

0.05

0.01

 

10.0

4.0

2.0

1.0

0.5

0.1

 

1.0 mg l-1

0.1

0.4

0.2

0.1

0.05

0.001

 

0.5

2.0

1.0

0.5

0.25

0.05

 

1.0

4.0

2.0

1.0

0.5

0.1

 

10.0

40.0

20.0

10.0

5.0

1.0

 

10.0 mg l-1

0.1

4.0

2.0

1.0

0.5

0.1

 

0.5

20.0

10.0

5.0

2.5

0.5

 

1.0

40.0

20.0

10.0

5.0

1.0

 

10.0

400.0

200.0

100.0

50.0

10.0

 

 

 

Esterilização dos meios de cultura

A esterilização dos meios de cultura é realizada por autoclavagem (em geral 121ºC, 1 bar) dependendo o tempo mínimo de esterilização do volume de meio no recipiente a esterilizar. A tabela II pode servir de guia para determinar o tempo mínimo de esterilização para meios de cultura.

 

Tabela IV. Tempo mínimo de esterilização em autoclave (121ºC, 1 bar) para meios de cultura

 

Volume de meio

por recipiente (ml)

Tempo mínimo de

autoclavagem (min)

Volume de meio

por recipiente (ml)

Tempo mínimo de

autoclavagem (min)

25 20 500 35
50 25 1000 40
100 28 2000 48
250 31 4000 63

 

Agentes gelificantes

A tabela IV pode ajudar na selecção do tipo de agente gelificante segundo o propósito da cultura in vitro a realizar.

 

Tabela V. Tipos de agente gelificantes, características e usos recomendados.

 

Descrição

Quantidade por litro (g)

Temp. de gelif. ºC

pH

a 1.5%

Cinzas %

Conteúdo iónico

 (análise típco ICP)

   Ca        Mg        K         P

1. Ágar

6-12

32-35

7.0-7.5

2-5

0.30

0.10

0.01

0.01

2. Ágar Bacteriológico

6-12

32-39

6.5-7.5

3-7

0.17

0.09

0.08

 _

3. Ágar tipo A

6-12

26-28

7.2-7.7

5-6

0.01

0.01

0.1

0.17

4. Ágar Tipo E

5-10

26-28

7.5-8.0

3-4

0.02

0.02

0.07

0.13

5. Ágar Tipo M

5-11

34-36

7.0-7.5

3-6

0.09

0.14

0.07

0.01

6. Ágar Alta Gelif.

4-8

34-37

6.5-7.0

3-4

0.03

 

0.07

0.09

7. Ágar Purificado

6-12

30-35

6.5-7.0

2.0

0.02

0.01

0.01

0.01

8. Ágar Lavado

6-10

25-27

7.0-7.5

2.2

0.15

0.08

_

_

9. Agarose

6-10

26-30

7.0-8.0

<1

_

_

_

_

10 Ácido Algínico

_

_

_

_

0.17

0.01

2.3

_

11. Agargel

3.5-5.0

26-28

7.2-7.7

4.5

0.25

0.06

0.04

0.08

12. Phytagel

1.5-2.5

27-31

6.5-7.0

9.5

0.85

0.35

1.70

0.15