BIOTECNOLOGIA DO PINHEIRO MANSO
(Pinus pinea L.)

 

 

Objectivos

Os trabalhos de cultura in vitro do pinheiro manso (Pinus pinea L.), realizados no Laboratório de Melhoramento e Biotecnologia Vegetal do ICAM, têm como objectivo desenvolver técnicas  adequadas á multiplicação clonal de plantas de procedência e características desejadas e contribuir para o melhoramento da espécie. Para alcançar estes objectivos foram realizados trabalhos nas seguintes áreas da cultura in vitro: 1. Propagação via organogénese a partir de cotilédones de sementes maduras; 2. Enraizamento dos rebentos obtidos via organogénese; 3. Micorrização  in vitro das plantas enraizadas provenientes dos rebentos obtidos via organogénese; 4. Isolamento de protoplastos e transformação genética; 5. Obtenção de embriões somáticos.

 

Resultados obtidos por metodologia de trabalho

Técnica: organogénese a partir de cotilédones

Resultados: Os resultados obtidos através de vários anos de investigação permitem-nos hoje contar com um protocolo fiável para multiplicar clonalmente plantas de pinheiro manso. Os cotilédones usados para iniciar as culturas são retirados de  sementes obtidas em stands de plantas seleccionadas (Região de Alcácer do Sal- DRAA) e armazenadas a 4ºC até a sua utilização. Os cotilédones de cada semente (12-14), previamente desinfectados, são colocados em caixas de Petri com meio de cultura WPM (Lloyd & Mc Cown, 1980), para indução de rebentos. Este meio é suplementado com 5 mg l-1 de BAP, 30 g l-1 de sacarose e 8 g l-1 de Difco-Bacto agar. As condições físicas da cultura são: 16 h luz (lâmpadas fluorescentes cool-white, 80 mmol s-1 m-2) e  25/19 º C dia/noite.

 

 Os micro-rebentos são posteriormente colocados no mesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento e com 20 g l-1 de sacarose e (0.2 %) carvão activado para o alongamento. Por esta via conseguem-se como média uns 150 rebentos por cotilédone, que passam a seguir ao alongamento para a fase de multiplicação.

 

Técnica

Enraizamento dos rebentos obtidos via organogénese

Resultados. As dificuldades no enraizamento de plântulas de Pinheiro manso é como noutras espécies de Gimnospérmicas um factor limitante para a aplicação da micropropagação a escala comercial. Mediante uma série de ensaios foram testadas diferentes condições de enraizamento, o que permitiu uma melhoria considerável nas taxas de enraizamento de rebentos.

O meio de base para enraizamento é constituído por meio de WPM (Lloyd &  Mc. Cown, 1980), suplementado com 2 mg l-1 NAA (Ácio-Naftaleno-Acético). Para melhorar a percentagem de plantas enraizadas foram realizados ensaios com diferentes combinações de carbohidratos (glucose; sacarose), reguladores de crescimento (NAA; IBA; IAA, etc.) e temperaturas (19º e 25 ºC) durante a fase de indução do enraizamento in vitro. As principais conclusões dos ensaios podem ser resumidos como:

 A glucose foi a melhor fonte de carbono para a rizogénese, especialmente influência o número de raízes formadas por planta;

 

a combinação por uma parte de baixas temperaturas e alta concentração de carbohidratos na fase de indução, e por outra de  altas temperaturas e menor concentração de carbohidratos na fase de expressão da rizogénese incrementa o enraizamento para a maioria dos clones testados.

Com estes trabalhos, foi possível incrementar a percentagem de plantas enraizadas até mais de 75 % para os clones rizogénicos.

 

 

 

Técnica

Micorrização in vitro das plantas enraizadas provenientes dos rebentos obtidos via organogénese (Em colaboração com o Dr. Paulo Oliveira)

Resultados: Por meio da metodologia desenvolvida no nosso laboratório (co-cultura de rebentos de pinheiro na fase posterior ao enraizamento e ectomicorrizas, em meio bi-camada) foi possível obter plantas micorrizadas com a maior parte dos fungos testados. Os trabalhos realizados podem ser resumidos nas seguintes fases:

  • recolha de fungos no Pinhal de Valverde
  • identificação das micorrizas
  • obtenção de culturas puras
  • micorrização in vitro  na fase de enraizamento

 

As vantagens desta técnica podem ser resumidas como: activação de novos pontos de crescimento das raízes das plântulas de pinheiro na fase de cultura in vitro,  menores perdas e uma melhor aclimatação das plântulas comparativamente com as plantas não micorrizadas. Uma colecção destes clones micorrizados está pronto a ser instalado no campo (Instalação de um banco clonal em Alcácer do Sal).

 

 

 

 

Técnica: Isolamento de protoplastos e transformação genética

Resultados: Para o isolamento foi usada uma solução contendo 0.6 M de manitol e 25 mM de MES onde foram dissolvidas as enzimas (2% de celulase e 0.1 % de pectoliase). Foram obtidos protoplastos viáveis após 5 horas de digestão a 25ºC e em leve agitação. O seguinte passo será ajustar as condições de purificação dos protoplastos e dos meios para cultura de protoplastos do pinheiro.

 

 

 

Técnica Obtenção de embriões somáticos

Resultados:  Não tem sido possível até o momento obter calos embriogénicos.

 

 

Estes Trabalhos foram apresentados nos seguintes Congressos Nacionais e Internacionais.

Potes, M. A. and Cavaleiro C. 1999. “Optimisation of rooting and acclimation of Stone Pine micropropagated plants (Pinus pinea L.) obtained via organogenesis”. Acta of the Spanish Congress of  Tissue Culture.  Málaga, Spain.

Barriga, J.; Oliveira, P.; Romano, A; Potes, A. 1999. “Diversity of ectomycorhizal fungi associated to Pinus pinea stands. Acta of  the II Meeting on Biodiversity. Porto.

Potes, M. A. and Cavaleiro C. 1999. “Optimisation of rooting and acclimation of Stone Pine micropropagated plants (Pinus pinea L.) obtained via organogenesis”. Acta of the Spanish Congress of Tissue Culture.  Málaga, Spain.

Barriga, J.; Oliveira, P.; Romano, A; Potes, A. 1999. “Diversity of ectomycorhizal fungi associated to Pinus pinea stands. Acta of  the II Meeting on Biodiversity. Porto.

Publicações

Potes, A.; Cavaleiro C.; Alves S. 2001. Advances in the in vitro rooting of Pinus pinea L. shoots obtained via organogenesis. Accepted for publication in Acta Horticultura, Special nº for the Acclimatization and Establishment of Micropropagated Plants Congress (Sani-Greece).

Oliveira P.; Barriga J.; Cavaleiro C.; Peixe A.A; Potes A.; 2001. Sustained in vitro root development in Pinus pinea L. inoculated with ectomycorhizal fungi.  In review for publication